乳香精油、沒(méi)藥精油和其熏香抵御神殿室內(nèi)中的微生物。這是古人的智慧嗎？

Milica Ljaljevi?Grbi? , Nikola Unkovi?, Ivica Dimki?,Pe?a Jana?kovi?, Milan Gavrilovi?, Olja Stanojevi?,Milo? Stupar, Ljubodrag Vujisi?,Aleksa Jeliki?, Slavi?a Stankovi?,Jelena Vukojevi?

a University of Belgrade, Faculty of Biology, Institute of Botany and Botanical Garden “Jevremovac”, Takovska 43, 11 000 Belgrade, Serbia b Institute for the Protection of Cultural Monuments in Serbia, Conservation and Restoration Department with Physico-Chemical Laboratory, Radoslava Gruji?a 11, 11 000Belgrade, SerbiacUniversity of Belgrade, Faculty of Chemistry, Studentski trg 12-16, 11 000 Belgrade, Serbia

摘要 民族藥物學(xué)相關(guān)性：從阿拉伯乳香和沒(méi)藥的樹(shù)脂中提取出的精油分別俗稱(chēng)乳香和真沒(méi)藥精油，自公元前2800年以來(lái)，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中廣泛用于治療皮膚潰瘍、傷口、牙齒、炎癥和泌尿道疾??；用于制作木乃伊香膏和軟膏；還有熏香和香水。自古以來(lái)，在宗教場(chǎng)所為精神目的和冥想而燃燒乳香和沒(méi)藥（在各種宗教中普遍存在）具有衛(wèi)生功能，通過(guò)凈化室內(nèi)空氣來(lái)凈化氣味和減少傳染病。

研究目的：本研究的一般目的是評(píng)估乳香（B.carteri）和沒(méi)藥（C.myrha）精油和其熏香在液相和氣相條件下的體外抗菌能力，以及測(cè)試其在調(diào)查過(guò)的17世紀(jì)建造的教堂環(huán)境中，用于凈化被微生物污染的空氣的原位抗菌活性有效性。

材料和方法：水蒸氣蒸餾法提取乳香和真沒(méi)藥油樹(shù)膠樹(shù)脂，得到乳香和沒(méi)藥揮發(fā)油的化學(xué)成分采用GC-MS 測(cè)定，并采用微量肉湯稀釋法和微大氣擴(kuò)散法評(píng)估其液相和汽相的抗菌性能。從二氯甲烷為溶劑的洗氣瓶中獲得燒熏香的煙氣，采用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行化學(xué)分析，同時(shí)采用改進(jìn)的微大氣擴(kuò)散法評(píng)估其抗菌活性，以評(píng)估其對(duì)真菌的發(fā)芽抑制和對(duì)細(xì)菌的CFU計(jì)數(shù)降低。分別在教堂的密封中殿和圣器室內(nèi)評(píng)估了乳香熏香和精油氣相的原位抗菌活性。

結(jié)果：乳香精油的主要成分為α-蒎烯（38.41%）和月桂烯（15.21%），而沒(méi)藥精油的特點(diǎn)是呋喃酮-1,3-二烯（17.65%）含量高，其次是莪術(shù)烯（12.97%）、β-欖香烯（12.70%）和大根香葉烯（12.15%）。熏香的煙霧和煙灰中的α-蒎烯（68.6%）和因香酚（28.6%）分別對(duì)應(yīng)乳香和沒(méi)藥的最主要化合物。體外抗菌試驗(yàn)表明，細(xì)菌和真菌對(duì)精油的液相和氣相以及熏香煙霧高度敏感。原位抗菌使用乳香精油的蒸汽和熏香的煙霧導(dǎo)致空氣傳播的活菌微生物分別減少45.39±2.83%和67.56±3.12%；真菌為80.43±2.07%，細(xì)菌（熏香）為91.43±1.26%。

結(jié)論：乳香精油是一種傳統(tǒng)用途廣為人知的化合物，其抗菌性能表明其作為天然抗菌劑具有明顯的潛力。此外，研究結(jié)果表明，除了日常的教堂儀式外，在神圣的氛圍中，也可以偶爾使用乳香精油揮發(fā)相和熏香煙霧作為空氣凈化的手段。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌；乳香；教堂；沒(méi)藥；真菌；樹(shù)脂

1.     引言

微生物，包括古菌、細(xì)菌和真菌，以及地衣和害蟲(chóng)，由于其明顯的生物退化潛力，不斷給遺產(chǎn)古跡以及博物館和私人藝術(shù)收藏中儲(chǔ)存和展示的各類(lèi)歷史文物的保護(hù)帶來(lái)諸多問(wèn)題（Sterflinger和Pi?ar，2013）。為了修復(fù)最近或進(jìn)行中的微生物損傷，目前可用的物理和化學(xué)方法范圍有限（Allsopp等人，2004年）。使用液體殺菌劑或熏蒸進(jìn)行的化學(xué)處理意味著使用歐盟殺生物產(chǎn)品指令（BPD）（歐盟編號(hào)528/2012）批準(zhǔn)的少量合成殺生物劑。在選擇用于控制遺產(chǎn)場(chǎng)所微生物污染的適當(dāng)藥劑時(shí)，有幾個(gè)特點(diǎn)，例如顯著的抗菌潛力、對(duì)附近人員的毒性最小或沒(méi)有毒性、環(huán)境污染低風(fēng)險(xiǎn)，以及不干擾藝術(shù)作品的結(jié)構(gòu)組件，必須加以考慮。從世界各地用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的植物中獲得的天然產(chǎn)物（特殊代謝物），如精油（EOs），已知具有抗菌能力，盡管缺乏足夠的科學(xué)證據(jù)，但被認(rèn)為或多或少對(duì)人類(lèi)無(wú)害。這促進(jìn)了精油在醫(yī)學(xué)、芳香療法和各種形式的消費(fèi)品中的全球應(yīng)用（Lahlou，2004年；Camarda等人，2007年）。由于精油主要由各種類(lèi)型的化合物組成，如萜烯類(lèi)、萜類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)等，其中許多是揮發(fā)性的（Laird和Phillips，2011），它們代表了商業(yè)合成劑的天然替代品，因?yàn)槲⑸锊惶赡墚a(chǎn)生耐藥性。

橄欖科乳香屬和沒(méi)藥屬的植物僅生長(zhǎng)在阿拉伯半島南部（也門(mén)和阿曼）、印度、馬達(dá)加斯加、東北非洲、索馬里、肯尼亞、埃塞俄比亞和蘇丹的干旱地區(qū)，分別出產(chǎn)具有文化和商業(yè)重要性的乳香和沒(méi)藥的油樹(shù)膠樹(shù)脂（Baser等人，2003年；Hamm等人，2005年）。乳香和真沒(méi)藥最重要的來(lái)源是由硬化的芳香樹(shù)脂滲出物大部分是天然獲得的，或者是從乳香樹(shù)和沒(méi)藥樹(shù)樹(shù)皮的切口中獲得的。通過(guò)對(duì)這些樹(shù)膠樹(shù)脂進(jìn)行水蒸餾獲得的精油通常非常稠密，具有溫暖、甜蜜和辛辣的氣味（Mikhaeil 等人，2003）。

從歷史上看，乳香和沒(méi)藥的使用可以追溯到公元前2800年，正如古埃及的醫(yī)療記錄所述，乳香和沒(méi)藥被用作熏香和香水，以及制作木乃伊用的軟膏和香膏。它們的聯(lián)合使用在《紙草埃伯斯》中有很好的記載，這是一組約公元前1500年的處方，其中它們被用于治療皮膚潰瘍和傷口（Michie和Cooper，1991年）。因此，在撰寫(xiě)《圣經(jīng)》時(shí)，乳香和沒(méi)藥是眾所周知的，它們被廣泛引用，被認(rèn)為是最常提到的芳香樹(shù)脂（De Rapper et al.，2012）。在基督教中，黃金、乳香和沒(méi)藥是圣誕節(jié)故事的關(guān)鍵部分，因?yàn)樗鼈兪侨恢钦撸˙althasar, Melchior和Gaspar)）送給嬰兒耶穌的禮物（《馬太福音》2:11，新約圣經(jīng)）。過(guò)去，在寺廟和其他禮拜場(chǎng)所點(diǎn)燃乳香和沒(méi)藥會(huì)產(chǎn)生煙霧，用于通過(guò)凈化空氣來(lái)減少氣味和傳染（Michie和Cooper，1991年）。乳香、沒(méi)藥蒸氣和油的抗菌特性早在公元前11世紀(jì)就已為人所知，當(dāng)時(shí)蘇美爾人用沒(méi)藥治療牙齒和腸道寄生蟲(chóng)，而乳香的抗菌用途可追溯到公元11世紀(jì)，當(dāng)波斯哲學(xué)家和醫(yī)生阿維森納使用乳香油治療尿路炎癥和感染時(shí)（Michie和Cooper，1991年）。如今，已經(jīng)開(kāi)展了大量研究，支持乳香和沒(méi)藥作為免疫增強(qiáng)劑、麻醉劑、抗過(guò)敏劑、抗炎劑、抗風(fēng)濕劑、抗焦慮劑、抗抑郁劑、抗癌劑、抗氧化劑和抗菌劑的傳統(tǒng)用途（Michie和Cooper，1991年；De Rapper等人，2012年；Shen等人，2012年）。

本研究的主要目的是評(píng)估熏香的體外和原位抗菌能力，以及通過(guò)水蒸氣蒸餾法從乳香和真沒(méi)藥樹(shù)脂中獲得乳香和沒(méi)藥精油的液相和氣相，以對(duì)抗從調(diào)查的教堂空氣中分離出的細(xì)菌和真菌。

2.材料和方法

2.1.實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)

Holy Ascension老教堂位于 Veliki Kr?imir （Gornje Zaplanje, Gad?in Han, Serbia）村莊的蘇瓦普蘭尼納山脈的西南坡上（北緯43°05′28′，東經(jīng)22°12′40′）。它建于17世紀(jì)，由石灰砂漿制成的大塊磨光石（siga）構(gòu)成，代表著一個(gè)細(xì)長(zhǎng)的半球形拱頂結(jié)構(gòu)（6.5×12m），帶有一個(gè)半圓形后堂，上覆山墻屋頂。沿著側(cè)墻有一對(duì)壁柱，內(nèi)部分為兩個(gè)過(guò)道。教堂壁畫(huà)的碎片，包括《舊約》和《新約》中的場(chǎng)景，大部分仍保存在中堂、祭壇區(qū)域和西立面（Deljanin，1995年）。目前，尼什文化遺跡保護(hù)研究所的一項(xiàng)指令（SK305，“RS官方公報(bào)”第28/83號(hào)）將該教堂列為一個(gè)非常重要的文化遺跡。

2.2.試驗(yàn)微生物分離株

2.2.1.真菌分離株和培養(yǎng)條件

以下真菌分離株用于測(cè)定精油和熏香煙霧的體外抗真菌效率：黃曲霉（BEOFB 313m）、黑曲霉（BEOFB 343m）、歐洲曲霉（BEOFB 381m）、枝狀枝孢菌（BEOFB1821m）、夏孢生 枝孢菌（BEOFB 1841m）、澳大利亞彎孢霉菌（BEOFB 713M）、比萊青霉（BEOFB1131m），羊毛狀青霉菌（BEOFB 1161m）和阿托血球青霉菌（BEOFB 1171m）。本研究中使用的真菌為腐性或致病性/產(chǎn)毒物種，分布于世界各地，主要為空氣傳播和小孢子（Florian，2004），從調(diào)查的教堂空氣中獲得（Unkovi?等人，2017年），并通過(guò)ITS的I和β-微管蛋白基因測(cè)序確定。分離株保存在低溫瓶中，溫度為1.5毫升30%甘油? 75°C（ViVar等人，2013）沉積在貝爾格萊德大學(xué)真菌培養(yǎng)所-生物學(xué)院（BEOFB）。分生孢子懸浮液（1.0×105 CFU /mL）根據(jù)Unkovi?等人（2018）中給出的方案制備，并儲(chǔ)存于?20℃。試驗(yàn)前，將稀釋的接種物培養(yǎng)在固體MEA上，以檢查其有效性并驗(yàn)證是否存在污染。

2.2.2. 細(xì)菌分離株和培養(yǎng)條件

使用空氣采樣器（MAS-100 Eco，Merck）從調(diào)查教堂的空氣中獲得細(xì)菌分離株，氣流設(shè)置為100 L/min。使用BHI（腦心輸液，Lab M）和TSA（胰蛋白酶大豆瓊脂，Merck）生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌。分離株在30℃有氧培養(yǎng)24小時(shí)。在形態(tài)學(xué)分析和革蘭氏反應(yīng)的基礎(chǔ)上，考慮對(duì)23株細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步分析。將懸浮液調(diào)整至麥克法蘭標(biāo)準(zhǔn)濁度（0.5）（BioMérieux，Marcy-léoile），相當(dāng)于約1.0×108CFU /mL。

對(duì)于分離株的分子鑒定，根據(jù)Dimki?等人（2013）所述程序的修改版本分離基因組DNA。在13000 rpm下離心過(guò)夜培養(yǎng)物5分鐘后，細(xì)胞重新懸浮，并在37℃下在含有200μg /mL溶菌酶（Serva GMBH）的500μL裂解緩沖液（TE，pH 7.6；50 mM TRIS；1 mM EDTA）中培養(yǎng)30分鐘，用于革蘭氏陽(yáng)性分離株，或在500μL的TE緩沖液中加入0.5%的十二烷基硫酸鈉（SDS）和100μg/mL蛋白酶K（Sigma-Aldrich）作為革蘭氏陰性分離株。離心（13000rpm，5分鐘）后，在500μL TEN洗滌緩沖液（50 mM TRIS，pH 8；10 mM EDTA，pH 8；50 mM NaCl）中洗滌顆粒，然后添加250μL 2%十二烷基硫酸鈉和250μL苯酚-氯仿。離心步驟（13000 rpm，10分鐘）后，收集上層水相，進(jìn)一步的分離步驟包括添加1/10體積的3 M醋酸鈉（pH 4.8）和1體積的異丙醇。將混合物離心（13000 rpm，15分鐘），通過(guò)乙醇沉淀法回收DNA，并將其溶解在含有1μL RNA酶混合物（10 mg/mL）的50μL TE緩沖液中。

從PCR擴(kuò)增片段中確定了所選菌株的16S rRNA基因序列。使用通用引物UN116sF（GAGAGTTGGC）和UN116sR（AGGTGCG）擴(kuò)增16S rRNA基因（1500 bp）。在30μL含有1.5μL模板DNA的反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2.4μL 25mM氯化鎂（KAPA生物系統(tǒng)）；3μL 10×KAPA-Taq緩沖液（KAPA生物系統(tǒng)）；0.6μL dNTP（每種10mM）混合物；每種底層涂料1.2μL；1.5μL Taq聚合酶（KAPA生物系統(tǒng)）；和19.95μL無(wú)核酸酶水（Gibso）。PCR反應(yīng)在94℃下進(jìn)行5分鐘的初始變性步驟，然后在94℃下進(jìn)行30秒的30個(gè)循環(huán)，在50℃下進(jìn)行1分鐘的引物退火，并在72℃下延長(zhǎng)30秒，然后在72℃下進(jìn)行最后的延長(zhǎng)步驟，持續(xù)7分鐘。使用QIAquick PCR純化試劑盒KIT/250（QIAGEN GmbH）純化PCR產(chǎn)物，并將其發(fā)送至荷蘭的Macrogen測(cè)序服務(wù)機(jī)構(gòu)進(jìn)行測(cè)序。獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（國(guó)家生物技術(shù)信息中心Blast搜索工具）中先前測(cè)序的基因進(jìn)行同源性搜索，最相關(guān)的菌株類(lèi)型序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析。所有序列均使用在BioEdit 7.2.6中實(shí)現(xiàn)的Clustal W多序列比對(duì)進(jìn)行比對(duì)，并使用基于成對(duì)距離矩陣的鄰接法和Kimura雙參數(shù)核苷酸替換模型在MEGA 6中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用1000個(gè)重復(fù)的獨(dú)立重采樣方法對(duì)系統(tǒng)樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行了評(píng)估。

2.3. 植物材料

乳香和沒(méi)藥油樹(shù)膠樹(shù)脂（www.theplantlist.org；15.11.2017）是NOP（國(guó)家有機(jī)項(xiàng)目）和VOF（佛蒙特州有機(jī)農(nóng)場(chǎng)主）認(rèn)證的商業(yè)樣品（批號(hào)BC000103和CM000102），從伊斯梅爾進(jìn)口有限責(zé)任公司（Burlington, Vermont）獲得，最初在索馬里蘭共和國(guó)收獲得到（http://www.boswellness.com/products/）。

2.4. 生物殺菌劑

從塞爾維亞文物保護(hù)研究所獲得了50%（v/v）的苯扎氯銨（BAC）水溶液。在實(shí)驗(yàn)之前，在無(wú)菌去離子水中稀釋殺菌劑，以制備最終濃度為3%（v/v）的儲(chǔ)備溶液。

2.5. 精油的分離

根據(jù)《歐洲藥典》中所述的程序，使用克利文杰型儀器，通過(guò)水蒸氣蒸餾3小時(shí)，從油樹(shù)膠樹(shù)脂（65.00 g）中分離精油（歐洲藥典，第6版，2007年）。這些油在4℃的黑暗中儲(chǔ)存，直到進(jìn)一步分析。

2.6. 燃燒熏香和提取煙霧和煙灰

使用專(zhuān)門(mén)為此目的設(shè)計(jì)的設(shè)備燃燒熏香和提取煙霧和煙灰。將乳香油樹(shù)膠樹(shù)脂（約5.00 g）放在木炭塊上，放在真空干燥器中的石棉網(wǎng)上燃燒，并在真空泵的幫助下將煙霧轉(zhuǎn)移到Drechsler瓶中，在溶劑水平下進(jìn)行氣體清洗。二氯甲烷用于萃取。此外，部分煙霧以煙塵的形式沉積在真空干燥器龍頭的掛鉤上，并使用超聲波浴用二氯甲烷萃取。樣品，即溶解在二氯甲烷中的煙霧和煙灰，用于GC-FID和GC-MS分析。在相同條件下進(jìn)行分析，不使用油樹(shù)脂燃燒的木炭塊用作陽(yáng)性對(duì)照。

2.7 氣相色譜/質(zhì)譜（GC-FID和GC/MS）分析

GC-FID和GC/MS分析使用安捷倫7890 A儀器進(jìn)行，該儀器配備5975 C質(zhì)量選擇檢測(cè)器（MSD）、火焰離子化檢測(cè)器（FID）和HP-5 MSI熔融石英柱（柱長(zhǎng)30 m，直徑0.25 mm，膜厚0.25 mm）。烘箱溫度線性編程，以3℃/min的速度從60℃上升到240℃；注射器溫度為220℃；探測(cè)器溫度為300℃；傳輸線溫度為240℃。載氣為He（210°恒壓模式下為1.0 mL/min），進(jìn)樣量為1μL，分流比為10:1。電子碰撞質(zhì)譜（EI-MS；70 eV）是在40–550m/z范圍上獲得的。使用NIST AMDIS（自動(dòng)質(zhì)譜去卷積和識(shí)別系統(tǒng)）軟件（版本2.64.113.71）進(jìn)行庫(kù)搜索和質(zhì)譜去卷積和提取，保留指數(shù)（RI）校準(zhǔn)數(shù)據(jù)分析參數(shù)設(shè)置為強(qiáng)水平，沒(méi)有RI的化合物將受到10%的罰函數(shù)法。RIs的實(shí)驗(yàn)測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)方法，包括在相同色譜條件下注入精油后的正構(gòu)烷烴保留時(shí)間（tR）。搜索是針對(duì)我們自制的圖書(shū)館進(jìn)行的，其中包含4972個(gè)光譜。根據(jù)GC峰面積計(jì)算鑒定化合物的相對(duì)含量。使用文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)確定并比較評(píng)估了庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)的化合物。（Brieskorn and Noble，1982、1983a、1983b；Wahab等人，1987年；Dolara等人，1996年；Hamm等人，2005年；Mohamed等人，2014年）

2.8.體外抗菌活性測(cè)定

2.8.1 Broth微稀釋試驗(yàn)

使用96孔微量滴定板（F-bottom，Ratiolab），通過(guò)連續(xù)稀釋技術(shù)（Hanel和Raether，1998）測(cè)定精油液相的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺真菌濃度（MFC）。不同體積的精油，以及3:1比例的乳香和沒(méi)藥精油的混合物，溶解在麥芽提取物肉湯（MEB）中，每孔10μL分生孢子懸浮液，以達(dá)到所需的精油濃度范圍在0.1至200 mg/mL。微滴定板在25±2℃（UE500，Memmert）下培養(yǎng)72小時(shí)。MIC值被確定為使用雙目顯微鏡（Stemi DV4，蔡司）觀察到的無(wú)明顯生長(zhǎng)的最低濃度。沒(méi)有可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低濃度被定義為MFC值，表明原始接種物的殺滅率為99.5%，這是通過(guò)在每孔含有100μL MEB的微滴定板上連續(xù)移種2μL，并在25±2℃下進(jìn)一步培養(yǎng)72小時(shí)來(lái)確定的。BAC被用作陽(yáng)性對(duì)照。

對(duì)于細(xì)菌分離株，使用微量肉湯稀釋法（Dimki?等人，2016年）測(cè)定MIC和最低殺細(xì)菌濃度（MBC）。第一個(gè)培養(yǎng)皿中精油的最終濃度為2 mg/mL使用MHB（Müller Hinton肉湯，HiMedia）進(jìn)行兩次連續(xù)稀釋?zhuān)邢♂尵鶠槿巍＜状甲鳛槿軇┑淖罱K濃度為10%。除了陰性對(duì)照和無(wú)菌對(duì)照外，還將抗生素鏈霉素、氨芐西林和利福平（Sigma-Aldrich）作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行了檢測(cè)。除無(wú)菌對(duì)照外，每孔均接種20μL細(xì)菌懸液（McFarland 0.5），最終體積為每孔200μL。最后，加入22μL Resazurin溶液（最終濃度為0.675 mg/mL向所有孔中加入Resazurin鈉鹽C12H6NNaO4，TCI），并在30℃下培養(yǎng)24小時(shí)。Resazurin是一種用于評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)的氧化還原指示劑。它是一種藍(lán)色、無(wú)熒光、無(wú)毒的染料，在活細(xì)胞內(nèi)被氧化還原酶還原為Resorufin時(shí)會(huì)變成粉紅色和熒光（Sarkeret al.，2007）。顏色沒(méi)有變化的最低濃度被確定為MIC值。此外，通過(guò)在Müller-Hinton瓊脂平板上無(wú)顏色變化地對(duì)每個(gè)孔中的試驗(yàn)稀釋液進(jìn)行二次培養(yǎng)并培養(yǎng)18–24小時(shí)來(lái)確定MBC。未顯示細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度被定義為MBC值。結(jié)果以mg/ mL表示。

根據(jù)鑒定結(jié)果和獲得的MIC值，選擇了15株細(xì)菌（MK 1.5、MK 2.1、MK 2.3、MK 2.4、MK 2.7、MK 3.2、MK 5.3、MK 5.4、MK 6.3、MK 7.1、MK 7.2、MK 8.1、MK 9.1、MK 9.3和MK 9.4）來(lái)檢測(cè)乳香和沒(méi)藥的精油之間的相互作用類(lèi)型（棋盤(pán)法，Schwalbe et al.，2007）。在兩個(gè)單獨(dú)的平板上分別對(duì)EOs進(jìn)行兩次連續(xù)稀釋?zhuān)瑵舛确秶鸀?.0至0.03 mg/mL。在一個(gè)平板上混合微孔內(nèi)容物，并測(cè)試所有36種可能的濃度組合。與MIC分析一樣，向每個(gè)孔中添加20μL的細(xì)菌懸浮液（包括細(xì)菌生長(zhǎng)控制），使每個(gè)孔的最終體積達(dá)到200μL。最后，向每個(gè)孔中添加22μLResazurin。在30°C下培養(yǎng)24小時(shí)后，顏色沒(méi)有變化的最低濃度再次被定義為特定精油組合的MIC值。測(cè)定了所有油的組合的協(xié)同作用、相加作用、無(wú)差異性或拮抗作用。單個(gè)油和不同油組合的MIC通過(guò)以下方式轉(zhuǎn)化為部分抑菌濃度（FIC）：

化合物A的FIC=化合物A在化合物B存在下的MIC/化合物A的MIC

化合物B的FIC=化合物B在化合物A存在下的MIC/化合物B的MIC

根據(jù)每種油的FIC值計(jì)算出的分級(jí)抑制濃度指數(shù)(FICi)如下：FICi=FICA+FICB

其中，A表示乳香精油，B表示沒(méi)藥精油。FICi解釋為：FICi≤0.5時(shí)表示協(xié)同效應(yīng)；FICi＞0.5-1時(shí)表示加性效應(yīng)；1＜FICi≤4時(shí)表示顯著效應(yīng)；FICi＞4時(shí)表示拮抗效應(yīng)（van Vuuren 和 Viljoen，2011）。

2.8.2.微大氣法

通過(guò)Maruzella和Sicurella（1960）的微大氣擴(kuò)散生物測(cè)定法的改進(jìn)版本，確定了乳香揮發(fā)油的揮發(fā)性階段誘導(dǎo)的分生孢子萌發(fā)抑制。試驗(yàn)在含有5mL MEA的皮氏培養(yǎng)皿（?50mm）中進(jìn)行。在培養(yǎng)基中心，注入30μL體積的分生孢子懸浮液，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿。用不同體積的精油（最終濃度為4、6、8、10和12 mg/cm3）浸泡的無(wú)菌濾紙盤(pán)（?1 mm）被放置在培養(yǎng)皿蓋的中心。皮氏培養(yǎng)皿在25±2°C下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)期結(jié)束后，接種皿的中心用乳酚棉藍(lán)（LCB）染色，放置蓋片，使用蔡司AxioImagerM1光學(xué)顯微鏡和AxioVision Release 4.6軟件觀察和測(cè)量隨機(jī)選擇的分生孢子的芽管。所有測(cè)量均一式三份，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

用同樣的方法研究了菌絲體和分生孢子對(duì)熏香煙霧的敏感性。為此，將含有5mL MEA的兩套三份皮氏培養(yǎng)皿（?50mm）分別接種羊毛狀青霉菌和澳大利亞彎孢菌的分生孢子和菌絲體懸浮液。將接種的皮氏培養(yǎng)皿放置在旁膜密封玻璃容器（空氣體積為2700 cm3）中30分鐘，在此期間，在木炭煤塊上連續(xù)燃燒5.00 g乳香油樹(shù)膠樹(shù)脂。對(duì)于分生孢子萌發(fā)試驗(yàn)，培養(yǎng)皿在25±2°C下培養(yǎng)24小時(shí)，而菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)在25±2°C下培養(yǎng)7天。在24小時(shí)的潛伏期后，以上述相同的方式測(cè)定分生孢子萌發(fā)抑制。另一方面，通過(guò)測(cè)量培養(yǎng)7天后的菌落直徑來(lái)監(jiān)測(cè)菌絲生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。使用Pandey等人（1982）的公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）：

抑制菌絲生長(zhǎng)（%）=100（dc-dt）/dc

其中，dc為對(duì)照組的真菌菌落的平均直徑，而dt為熏香煙氣處理后的真菌菌落的平均直徑。

此外，還測(cè)試了乳香精油的氣相和熏香煙霧的抗菌活性。在這兩種檢測(cè)中，對(duì)于所選的17種細(xì)菌分離株中的每一種，將100μL最佳稀釋的細(xì)菌過(guò)夜懸浮液分四次接種在MHB瓊脂平板表面。用360μL或180μL精油（分別為12 mg/cm3和6 mg/cm3）浸漬濾紙盤(pán)（?10 mm）放置在培養(yǎng)皿蓋上（?85 mm），而對(duì)照組缺少精油。對(duì)于涉及香熏的分析，將接種有細(xì)菌最佳稀釋液的MHB瓊脂板置于玻璃容器中，并將其暴露于木炭煤上燃燒香熏（5.00 g）中30分鐘，在此期間，容器用封口膜密封。在這兩種分析中，培養(yǎng)板在30°C下培養(yǎng)48小時(shí)，CFU/mL計(jì)算對(duì)照菌株和處理菌株的。

2.9 原位抗菌活性

使用符合教堂環(huán)境的芳香氣味室，研究了乳香精油和熏香煙霧的原位抗菌潛力。圣器室（墻壁上的壁畫(huà)孔，尺寸：40（寬）×55（高）×32（深）厘米）用于模擬原位條件和測(cè)試精油。在實(shí)驗(yàn)之前，通過(guò)被動(dòng)沉降法（Omelyansky，1940）估計(jì)了圣器室空氣中的微生物污染水平。將富含鏈霉素的MEA和M40Y（麥芽酵母40%蔗糖瓊脂）和MHA（Müller Hinton瓊脂）的復(fù)制培養(yǎng)皿（不含和含有制霉菌素（MHA+N））置于圣器室中，并暴露于正常氣流中30分鐘，以分別分離真菌和細(xì)菌。6小時(shí)后進(jìn)行原位處理，在此期間，正常的日?；顒?dòng)和氣流允許重新建立空氣微生物群的含量。在這段時(shí)間之后，在環(huán)境溫度（24.8±0.14°C）和相對(duì)濕度（41.65±0.49%）的條件下，將2mL的乳香精油在圣器室中蒸發(fā)30分鐘，同時(shí)使用開(kāi)放式的MEA、M40Y、MHA和MHA+N皮氏培養(yǎng)皿。圣器室用聚乙烯板密封在涂層塑料框架上，立即設(shè)置精油和皮氏培養(yǎng)皿，從而形成一個(gè)芳香氛圍（用飽和精油）。在實(shí)驗(yàn)室條件下，預(yù)防接種的皮氏培養(yǎng)皿在25±2°C下培養(yǎng)7天，然后計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的真菌和細(xì)菌菌落。每立方米空氣的CFU數(shù)（CFU /m3）根據(jù)Omelyansky（1940）公式估算：

N =5a x 10 4(bt) -1

式中，N為真菌/細(xì)菌CFU /m3，a為每個(gè)培養(yǎng)皿的真菌/細(xì)菌菌落數(shù)，b為培養(yǎng)皿表面(cm2)，t為暴露時(shí)間(min)。

為了評(píng)估熏香煙霧的原位抗菌能力，重復(fù)了實(shí)驗(yàn)，但有幾個(gè)不同之處：（1）熏香在帶有密封窗戶(hù)和門(mén)的中殿燃燒，以防止意外氣流，并允許形成芳香氛圍；（2） 將約5.00 g樹(shù)脂放在木炭煤塊上，燃燒至自熄；（3） 在煙霧處理前后，使用MAS-100生態(tài)空氣采樣器（100L-min?1）對(duì)空氣中的真菌和細(xì)菌進(jìn)行采樣；（4）根據(jù)Feller（1950）校正真菌和細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)值，并乘以10，表示為CFU /m3。

2.10 統(tǒng)計(jì)分析

獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA）和分離使用乳香的氣相和熏香進(jìn)行處理時(shí)的平均值CFU/mL。除此之外，還使用Tukey的HSD測(cè)試分析了不同濃度的乳香精油和苯扎氯銨揮發(fā)物對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制百分比。在P<0.05時(shí)，這些值被認(rèn)為是顯著的。所有稀釋液分四次重復(fù)測(cè)試，重復(fù)兩次。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的一般程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析版本7（StatSoft，Inc.）和IBM SPSS統(tǒng)計(jì)軟件版本20（SPSS公司）。

3.結(jié)果和討論

3.1精油的化學(xué)成分

乳香和沒(méi)藥油樹(shù)膠樹(shù)脂的精油[產(chǎn)率分別為2.28%和0.32%（w/w）]透明且有強(qiáng)烈的氣味。通過(guò)GC-FID和GC-MS分析，檢測(cè)到57種化合物（98.99%），其中56種被鑒定出，占乳香精油的98.84%（痕量中發(fā)現(xiàn)10種化合物）。另一方面，在沒(méi)藥精油中發(fā)現(xiàn)了40種化合物（98.87%），其中37種被鑒定出，占揮發(fā)油的98.19%（痕量中發(fā)現(xiàn)了2種化合物）。表1按洗脫順序列出了所有化合物。乳香精油中以單萜烯類(lèi)為主（87.51%），而沒(méi)藥精油中以倍半萜烯類(lèi)為主（58.76%）。乳香精油以占比極高的α-蒎烯（38.41%）和月桂烯（15.21%）為特征成分，其次是香檜烯（12.13%）和檸檬烯（6.24%）。沒(méi)藥精油中最主要的化合物是莪術(shù)呋喃-1,3-二烯（17.65%），其次是莪術(shù)烯（12.97%）、β-欖香烯（12.70%）、大根香葉烯B（12.15%）、大根香葉烯D（9.13%）、大根香葉烯A（5.87%）和香樟烯（5.34%）。

結(jié)果表明，乳香精油富含單萜烯類(lèi)化合物（88.73%），而沒(méi)藥精油富含倍半萜烯類(lèi)化合物（58.76%）。另一方面，乳香精油的倍半萜烯類(lèi)化合物含量較低（7.53%），而沒(méi)藥精油的單萜烴含量較低（0.34%）。眾所周知，揮發(fā)精油的定量和定性組成決定了精油的特性，即反映在它們的抗菌活性上（Laird和Phillips，2011；Ali等人，2008）。此外，精油的化學(xué)成分取決于植物的基因型，以及各種環(huán)境因素，如氣候、收獲時(shí)間和儲(chǔ)存條件（Mejri等人，2010年；De Rapper等人，2012年）。到目前為止，已經(jīng)對(duì)乳香精油的組成進(jìn)行了大量研究，單萜烯類(lèi)化合物通常被報(bào)道為主要化合物（Baser等人，2003年；Camarda等人，2007年）。在我們的工作中，乳香精油的組成與早期對(duì)索馬里乳香精油進(jìn)行的研究結(jié)果具有可比性。幾種化合物的存在明顯相似，如α-蒎烯、香檜烯、檸檬烯、α-側(cè)柏酮和對(duì)傘花烴（Abdulwahab等人，1987年；Chiavari等人，1991年），而在Wang等人（1993年）的研究中，乙酸辛酯和辛醇占主導(dǎo)地位。月桂烯是所研究的精油中的主要化合物之一，因此月桂烯的含量存在差異，但總體而言，月桂烯的含量相較于其他組分更高。

所研究的沒(méi)藥精油的特征是倍半萜烯類(lèi)含量高（58.76%），含氧倍半萜烯含量也相對(duì)較高（38.25%）。早期的研究也表明，沒(méi)藥油的特點(diǎn)是倍半萜的烯烴化合物和含氧倍半萜的含量高，但不含單萜烯烴化合物（Abegaz et al.，1989）。報(bào)道的主要成分包括α-欖香烯、7-異丙基-1,4-二甲基-2-澤瀉醇、莪術(shù)烯、大根香葉-1（10）7,11-三烯-15-油酸、8,12-環(huán)氧-6-羥基-?-內(nèi)酯、δ-欖香烯、δ-新丁香烯、大根香葉烯B和佛術(shù)烯（MortezaSemnani和Saeedi，2003）。此外，Marongiu等人（2005年）；Baser等人（2003年）表明，埃塞俄比亞的沒(méi)藥精油的主要化合物為莪術(shù)呋喃二烯-1,3-二烯、呋喃二烯、莪術(shù)烯、香樟烯和α-欖香烯。其中，莪術(shù)呋喃-1,3-二烯、莪術(shù)烯、δ-欖香烯、香樟烯和大根香葉烯B都是在我們的研究和上述研究中發(fā)現(xiàn)的化合物。

3.2. 熏香煙霧和煙灰中的化學(xué)成分

通過(guò)GC-FID和GC-MS分析，（乳香油樹(shù)脂）熏香的煙霧和煙灰中共含有34種化合物。在煙霧中檢測(cè)到12種化合物（100%），22種化合物（99.9%）。在22種煙灰化合物中，有2種（99.0%）被鑒定出來(lái)。表2按洗脫順序列出了所有化合物。結(jié)果表明，香熏煙霧中以單萜烯烴為主（99.4%）。此外，煙霧的特征成分是占比極高的α-蒎烯（68.6%），其次是香檜烯（9.9%）和α-側(cè)柏烯（7.0%）。在熏香煙灰中，含氧二萜類(lèi)化合物占主導(dǎo)地位（47.3%），其次是三萜烯類(lèi)化合物（25.3%）、二萜烯類(lèi)化合物（10.2%）和倍半萜烯類(lèi)化合物（7.2%）。香熏煙灰化合物中最主要的化合物是因香酚（28.6%），其次是異因香酚（18.7%）、24-降烏蘇-3,12-二烯（9.1%）、24-降烏蘇-3,9(11),12-三烯（6.4%）和新松柏烯（5.7%）。燃燒沒(méi)有任何化合物的木炭煤作為陽(yáng)性對(duì)照，在相同條件下進(jìn)行分析。

據(jù)我們所知，之前只有兩次嘗試分析熏香煙霧的化學(xué)成分，而此處首次使用第2.6節(jié)中所述的方法測(cè)定殘余煙灰的化學(xué)成分。Pailer等人（1981a、1981b、1981c）通過(guò)真空蒸餾從乳香樹(shù)脂的乙醚提取物中收集熱解產(chǎn)物；然而，這些研究的結(jié)果并不適用，因?yàn)闂l件不同于日常教會(huì)儀式中觀察到的情況。另一方面，Basar（2005年）的研究結(jié)果與本文所述的結(jié)果具有可比性，因?yàn)樵谶@兩種情況下，燒香的方式與教堂中燒香的方式相似。據(jù)報(bào)道，通過(guò)固相吸附測(cè)定，并通過(guò)GC和GC-MS研究，在紅熱木炭上燃燒乳香樹(shù)脂所形成的煙霧由因香酚（22.8%）、乙酸因香酯（15.5%）、乙酸辛酯（10%）、輪狀聚傘花-4(20),7,11-三烯（9.3%）、1-辛醇（4.0%）、松柏烯A（3.7%）和松柏烯 C（1.5%）（Basar，2005年）。盡管在煙灰中檢測(cè)到了因香酚（28.6%；最主要的化合物）和松柏烯A（2.5%），但我們研究的煙霧中沒(méi)有所報(bào)道的化合物。我們的研究與Basar（2005）的研究有相似之處，α-蒎烯是乳香精油和熏香煙霧中的主要化合物；但煙霧中含量更高（68.6%）。香檜烯也是主要化合物之一（9.9%）。另一方面，煙灰中主要是含氧二萜類(lèi)化合物，而精油和煙霧中缺少這類(lèi)特殊的代謝物。這是因?yàn)槎剖侵参飿?shù)脂不可分割的一部分，這是因?yàn)樗鼈兊幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和物理特性（較大的分子具有較高的分子量），這使得它們具有較高的沸點(diǎn)和較低的氧化速率，并有利于植物樹(shù)脂粘性的形成。在其他地方，已經(jīng)證明24-降烏蘇-3,12-二烯（24.45%）和因香酚（22.55%）是乳香油樹(shù)膠樹(shù)脂的主要化合物（Ammar等人，2013）。我們還發(fā)現(xiàn)因香酚（28.6%）和24-降烏蘇-3,12-二烯是乳香煙灰的主要成分。

3.3. 真菌對(duì)精油液相的敏感性

表3總結(jié)了八種致病和產(chǎn)毒真菌分生孢子期的乳香精油和沒(méi)藥精油的MIC和MFC值。在微量肉湯稀釋法中，高M(jìn)IC值（12.5–150 mg/mL）和MFC值（25-185.5mg/mL）表明，沒(méi)藥精油的抗真菌活性較低。歐洲曲霉是最易受沒(méi)藥精油處理得到的分離株，當(dāng)濃度為25 mg/mL時(shí)，這種真菌的生長(zhǎng)完全受到抑制。另一方面，最具耐藥性的分離株是比萊青霉。迄今為止的幾項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)，酵母菌，即白色念珠菌、新型隱球菌和釀酒酵母，對(duì)沒(méi)藥精油的液相敏感（De Rapper等人，2012年；Mohamed等人，2014年）。到目前為止，只有Prakash等人（2012年）報(bào)告了各種絲狀真菌的敏感性，這也是本次研究的主題。上述研究展示了沒(méi)藥精油對(duì)九種食源性霉菌的體外抗菌研究結(jié)果，其中包括黃曲霉、黑曲霉和枝狀枝孢菌。對(duì)于給定的分離株，同樣通過(guò)微量稀釋法測(cè)定的MIC值在2.5至3.5μL /mL的范圍內(nèi)。不幸的是，由于這種油的產(chǎn)量極低（0.32%），因此沒(méi)藥精油在原位抗菌的能力缺乏成本效益，因此無(wú)需進(jìn)一步考慮。

與沒(méi)藥精油相比，乳香精油的液相抗真菌活性顯著增強(qiáng)。對(duì)于大多數(shù)分離株，兩種受試精油之間的MIC和MFC值存在顯著差異，最顯著的是枝狀枝孢菌和夏孢生枝孢菌。一般而言，MIC值和MFC值的范圍為10至120 mg/mL用于測(cè)試的微真菌。黃曲霉被證明是最具耐藥性的分離株，其MIC和MFC值為120 mg/mL。另一方面，最敏感的真菌是球孢枝孢菌（MIC和MFC值為10 mg/mL )，以及枝狀枝孢菌和羊毛狀青霉（MIC分別為10 mg/mL和30 mg/mL )。受試枝孢菌分離株的顯著敏感性對(duì)于乳香精油原位抗菌應(yīng)用的潛力尤其重要，因?yàn)橥ㄟ^(guò)掃描電鏡觀察到，在Holy Ascension老教堂壁畫(huà)的高度退化區(qū)域，枝孢菌樣生殖結(jié)構(gòu)在地下大量存在（Unkovi?等人，2015b，2016）。雖然通常具有更強(qiáng)的抗真菌活性，但乳香精油對(duì)阿托血球青霉、羊毛狀青霉和歐洲曲霉的作用略弱于沒(méi)藥精油。與沒(méi)藥精油相比，乳香精油的抗真菌活性得到了更大程度的研究，之前的研究均勻地集中在酵母和絲狀真菌對(duì)精油處理的敏感性上（Prakash et al.，2014）?；谄涓弋a(chǎn)率（2.28%）和低MIC和MFC值，選擇乳香精油作為進(jìn)一步研究原位抗菌應(yīng)用的合適候選物。從Boswellia油樹(shù)膠樹(shù)脂中分離得到的精油其抗真菌活性來(lái)自于檸檬烯、芳樟醇和α-松油醇（Carson and Riley，1995；Pattnaik等人，1997；Aggarwal等人，2002），這些化合物也存在于本文研究的精油中。

乳香和沒(méi)藥精油以3:1的比例混合，與各自的油相比具有更強(qiáng)的抗真菌活性（表3）。記錄的MIC和MFC值范圍為4至100mg/mL對(duì)治療最敏感的真菌是夏孢生枝孢菌（MIC和MFC為4 mg/mL） 其次是枝狀枝孢菌（MIC為4 mg/mL）和10 mg/mL的MFC?1）和歐洲曲霉（MIC為4mg-mL?1和MFC20mg/mL) 另一方面，黃曲霉的MIC和MFC值為100 mg/mL，是最不敏感的分離株?；旌暇惋@示出協(xié)同作用（枝狀枝孢菌和夏孢生枝孢菌）和添加劑（歐洲曲霉和比萊青霉）特性，未觀察到拮抗作用。對(duì)于其余的受試曲霉菌和青霉菌，精油之間沒(méi)有相互作用的記錄。

在肉湯稀釋法中，所有研究精油的抗真菌活性潛力表現(xiàn)得比陽(yáng)離子表面活性季銨鹽化合物BAC弱，BAC用作陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于這種商用殺菌劑，MIC和MFC值在0.15至0.75 mg/mL范圍內(nèi)（表3）。黑曲霉和羊毛狀青霉最易受BAC處理的影響，在0.15mg/mL濃度下達(dá)到殺菌效果，而最具耐藥性的菌株是歐洲黑曲霉和黃曲霉（MIC和MFC為0.75 mg/mL ). 這種由低濃度的BAC引起的分生孢子萌發(fā)損失與關(guān)于這種氮基殺生物劑抗真菌活性的已發(fā)表數(shù)據(jù)完全一致（Tortorano等人，2005年；Vijayakumar等人，2012年；Xu等人，2013年；Unkovi?等人，2015a）。通過(guò)對(duì)堿性季銨鹽化合物的配方進(jìn)行各種修改而產(chǎn)生的許多殺菌劑產(chǎn)品，被BPD批準(zhǔn)用于保護(hù)文化遺產(chǎn)古跡，因?yàn)樗鼈兿鄬?duì)環(huán)保（Cooke，2002），并且經(jīng)常用于保護(hù)壁畫(huà)（DiazHerraiz et al.，2013）。然而，Scheerer等人（2009年）建議限制使用氮基殺菌劑，因?yàn)橐恍┪⑸飯F(tuán)體可以將其用作氮源，因此有利于再融合。此外，持續(xù)使用相同的殺菌劑可導(dǎo)致受試微生物的敏感性降低，這一趨勢(shì)已在BAC中得到報(bào)道（To等人，2002年；Langsrud等人，2003年）。盡管精油通常效果較差，但由于其可生物降解的性質(zhì)，以及精油本質(zhì)上代表了多種協(xié)同作用的主要和次要成分的混合物，因此預(yù)計(jì)精油比合成殺菌劑更有優(yōu)勢(shì)，從而最大限度地降低耐藥真菌菌株發(fā)展的可能性（Saxena和Mathela，1996年；Shaaban等人，2012年）。

3.4. 真菌對(duì)精油氣相的敏感性

Maruzella和Sicurella（1960）描述的標(biāo)準(zhǔn)化微大氣方法最初是為了闡明菌絲體對(duì)受試制劑蒸汽的敏感性，在芳香氛圍中形成的真菌菌落直徑被視為判斷抗真菌活性的標(biāo)準(zhǔn)（Lang和Buchbauer，2012）。然而，由于空氣傳播的分生孢子是文化遺產(chǎn)的主要污染源之一，因此決定測(cè)試所選精油的氣相部分對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響。圖1顯示了由乳香精油氣相階段誘導(dǎo)的分生孢子萌發(fā)抑制百分比。在所有受試精油濃度下，在枝狀枝孢菌和夏孢生枝孢菌中觀察到完全抑制分生孢子萌發(fā)（100±0.0%），從而證實(shí)了通過(guò)微量肉湯稀釋法得到的這些分離株對(duì)乳香精油的顯著敏感性。在最大試驗(yàn)濃度（12 mg/cm3）下，對(duì)羊毛狀青霉（99.38±1.6%）、比萊青霉（95.37±1.6%）和歐洲黑曲霉（100.0±0.0%）也有相同的分生孢子萌發(fā)抑制作用，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。在最高精油濃度下觀察到對(duì)黑曲霉的最佳抑制（66.71±1.51%），而在相同濃度下觀察到對(duì)阿托血球青霉菌和黃曲霉的無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的活性。雖然Udomsilp等人（2009年），但之前還沒(méi)有用這種方法研究過(guò)真菌對(duì)精油氣相的敏感性；Ljaljevi? Grbi?等人（2011年）研究了與藥用植物中的精油接觸對(duì)幾種食源性真菌孢子萌發(fā)的影響，以及從尼泊爾海棠葉表面和種子中分離出的真菌，而Stupar等人（2016年）則證明了乳香精油的氣相部分對(duì)從文化遺產(chǎn)中分離出的真菌菌絲體的中度抗真菌作用。

我們的研究結(jié)果與最近公布的數(shù)據(jù)一致，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)精油的氣相比液相更有效，因?yàn)樗鼈冊(cè)谳^低濃度下具有更強(qiáng)的活性，并且由于其揮發(fā)性可用于更廣泛的環(huán)境，例如作為空氣去污劑（Laird and Phillips，2011）。我們的結(jié)果與Inouye等人（2006年）的結(jié)果一致，他們證明，對(duì)于由醇、酮、酯、氧化物和碳?xì)浠衔锝M成的精油，主要的抑制作用來(lái)自蒸汽。有人認(rèn)為，氣相的較高抗菌潛力是由于液相中親脂性分子的結(jié)合，從而形成膠束并抑制精油附著到微生物上，而氣相允許組分自由附著并插入細(xì)胞膜富含脂質(zhì)的部分，從而破壞了它的功能（Inouye等人，2000和2003年）。盡管如此，與大量證據(jù)表明精油液相的有效性相比，精油氣相的抗菌潛力研究相對(duì)較少，盡管它最近尤其是在文化遺產(chǎn)保護(hù)領(lǐng)域，受到了越來(lái)越多的關(guān)注。

在相同濃度的殺菌劑（12 mg/cm3）下記錄了羊毛狀青霉菌對(duì)分生孢子萌發(fā)抑制作用的比率為（77.27±2.59%），其次是歐洲曲霉（72.32±2.57%）和枝狀枝孢菌（72.43±3.93%）。在最高濃度的殺菌劑下，夏孢生枝孢菌和比萊青霉菌的活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。較低濃度的殺菌劑，4和6mg/cm3，在黑曲霉和枝狀枝孢菌中沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制，而黃曲霉在所有研究濃度下都具有完全抗性。兩次應(yīng)用分析結(jié)果之間的差異可歸因于殺菌劑與微大氣中的分生孢子缺乏緊密接觸，液相和殺菌劑揮發(fā)性部分的作用機(jī)制不同，或者在環(huán)境溫度下BAC的蒸發(fā)率顯著降低。

圖1. 不同濃度（mg/cm3）的乳香精油和苯扎氯銨（BAC）氣相部分對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制程度（%）。同一字母后各測(cè)試濃度內(nèi)的不同抑制方式無(wú)顯著性差異（Tukey的HSD試驗(yàn)，P<0.05）。分生孢子萌發(fā)抑制率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差如圖所示。

3.5. 熏香煙霧的抗真菌潛力

采用改進(jìn)的微大氣擴(kuò)散法，在兩種選定的微真菌上評(píng)估了菌絲體和分生孢子對(duì)燒香煙霧的敏感性：具有小球形分生孢子的羊毛狀青霉；澳大利亞銀魚(yú)狀枝孢菌，一種真菌代表并具有大的黑色素化多節(jié)分生孢子。在這兩種處理過(guò)的菌株中，菌絲體對(duì)熏香煙霧的敏感度相同，對(duì)羊毛狀青霉的生長(zhǎng)抑制率為47.27±2.29%，對(duì)澳大利亞銀魚(yú)狀枝孢菌的生長(zhǎng)抑制率為44.75±1.51%。除了較小的菌落直徑外，培養(yǎng)物中未觀察到其他形態(tài)生理學(xué)變化。

經(jīng)過(guò)30分鐘的煙霧處理，羊毛狀青霉分生孢子的萌發(fā)完全受到抑制（100±0.0%），而澳大利亞銀魚(yú)狀枝孢菌的萌發(fā)受到高度抑制（92.65±1.56%），其特征是出現(xiàn)了長(zhǎng)度為10.78±2.13μm的微小芽管。在后者中，由于機(jī)械和化學(xué)影響，從煙霧中排出的一層薄薄透明的蠟狀層阻礙了芽管的正常形成和菌絲生長(zhǎng)。大分生孢子具有終末萌發(fā)和強(qiáng)健的菌絲，是觀察點(diǎn)燃熏香煙霧誘導(dǎo)的抑制作用的理想材料。這些結(jié)果表明，精油的抗菌性能也存在于熏香中（以α-蒎烯為主的化合物，在兩種菌中分別占38.41%和68.6%），這表明需要進(jìn)一步研究。

3.6. 細(xì)菌分離與系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)形態(tài)學(xué)分析和革蘭氏反應(yīng)，選擇了23株空氣中的細(xì)菌菌株，并用于進(jìn)一步的分子鑒定。根據(jù)BLASTn分析，基于16S rDNA，至少有15種不同的物種被確認(rèn)存在。基于菌株MK 2.1和MK 3.2核苷酸序列的相似性，系統(tǒng)發(fā)育重建將它們與沙芬西芽孢桿菌NBRC 100820（NR_113945）和短小芽孢桿菌NBRC 12092（NR_112637）聯(lián)系起來(lái)，具有相同的識(shí)別率（99.5%）。然而，Bootstrap共識(shí)樹(shù)（數(shù)據(jù)未顯示）表明，分離株MK 2.1與短小芽孢桿菌更相似。分離株MK 1.3、MK 1.4、MK 6.3和MK 7.2也獲得了類(lèi)似的結(jié)果，這些分離株被鑒定為藤黃微球菌NCTC2665（NR_075062）或蘆薈微球菌AE-6（NR_134088）。進(jìn)行的BLASTn分析表明，MK 7.2更可能是蘆薈微球菌（最高和總分：2122；查詢(xún)覆蓋率：99%，E值：0.0；縮進(jìn)率：99.4%）。此外，一些分離株被歸類(lèi)為單純芽孢桿菌LMG11160（NR_114919）（MK 1.1、MK 2.5、MK 4.1和MK 9.3）；或污染芽孢八疊球菌CCUG 53915（NR_116955）（MK 1.2、MK 2.7、MK 3.6和MK 6.1）。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，其余的分離株形成了一個(gè)由高Bootstrap值支持的單一分枝，這些分離株與來(lái)自相同或其他屬的物種最為相似，如圖2所示。

圖2. 基于16個(gè)S rDNA序列（1500 bp）的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示了23個(gè)受試菌株與相關(guān)參考菌株之間的關(guān)系。大于50的引導(dǎo)值（以1000次重復(fù)的百分比表示）將顯示在分支點(diǎn)。每條線表示遺傳距離為0.05。

3.7. 細(xì)菌對(duì)精油液相的敏感性

對(duì)所有受試菌株測(cè)定兩種精油的MIC和MBC值。獲得的MIC值在0.06至2 mg-mL范圍內(nèi)?1，沒(méi)藥精油中幾乎所有的分離株都更敏感（表4）。乳香精油的最低MIC值記錄為內(nèi)部寄生冷桿菌（0.06 mg/mL），類(lèi)棒菌狀紅球菌（0.25mg/mL），而其余菌株則更具耐藥性。對(duì)分離株MK 1.3（>2.00 mg/mL）測(cè)定了乳香精油的最高M(jìn)IC值。MBC值是MIC值的兩倍以上，濃度高于2mg-mL?1.大多數(shù)分離株，尤其是微球菌屬、芽孢桿菌屬和芽孢八疊球菌屬，在沒(méi)藥精油中表現(xiàn)出良好的敏感性，MIC值通常在0.06至0.19 mg/mL之間，這與受試抗生素的作用相當(dāng)。MBC值是MIC值的兩倍甚至更多倍，但與乳香精油中的 MBC值相比顯著更低。在本試驗(yàn)中，內(nèi)部寄生冷桿菌（MK 5.4）是對(duì)這兩種精油最敏感的菌株，并且對(duì)氨芐青霉素（0.2mg/mL）非常耐藥，而短小芽孢桿菌（MK 2.1）、解淀粉芽孢桿菌（MK 2.4）和辛德勒不動(dòng)桿菌（MK 9.1）的分離株對(duì)這兩種油最具耐藥性。有趣的是，分離株MK 9.4（屎腸球菌）（0.06 mg/mL）對(duì)沒(méi)藥精油敏感，同時(shí)對(duì)氨芐青霉素和鏈霉素有中度耐藥性。甲醇作為溶劑（對(duì)照）沒(méi)有抗菌活性。所有受試菌株對(duì)抗生素均表現(xiàn)出良好的敏感性（濃度范圍為0.003-0.40mg/mL），但少數(shù)對(duì)氨芐青霉素和鏈霉素表現(xiàn)出耐藥性（表4）。利福平對(duì)所有菌株而言有著最低的MIC值（0.03–0.013 mg/mL）。

在兩項(xiàng)獨(dú)立的研究中，Mohamed等人（2014、2016年）證明了幾種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌對(duì)沒(méi)藥精油抗真菌實(shí)驗(yàn)的顯著敏感性，MIC值在2-5μL/mL和100-1000 μL/mL之間。一份沒(méi)藥精油的商業(yè)樣品進(jìn)一步證實(shí)了其良好抗菌活性（Maree等人，2014年）。Saeed和Sabir（2004）表明，在從印度沒(méi)藥精油中分離的七種倍半萜類(lèi)化合物中，莪術(shù)烯對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌表現(xiàn)出最有效和持久的抑制活性。這一點(diǎn)很重要，因?yàn)樵谖覀兊臎](méi)藥精油中，莪術(shù)烯是第二主要的化合物（12.97%）。

為了確定每種精油對(duì)抗菌活性的貢獻(xiàn)，并確定它們之間的協(xié)同或拮抗作用，36種不同的精油濃度組合（1.0–0.031mg-mL?1）使用棋盤(pán)法（補(bǔ)充表1）進(jìn)行調(diào)查。根據(jù)物種水平的差異或獲得的MIC值，共選擇了15個(gè)菌株。MIC結(jié)果轉(zhuǎn)化為FIC和FIC指數(shù)，用于定義相互作用的性質(zhì)和類(lèi)型。對(duì)于所有受試菌株，兩種精油在不同組合中的最低濃度如表5所示。測(cè)試的組合顯示了所有類(lèi)型的相互作用，并對(duì)五個(gè)菌株（MK 2.1、MK 2.4、MK 3.2、MK 5.3和MK 9.1）的協(xié)同作用進(jìn)行了評(píng)分。有趣的是，分離株MK9.1是最具耐藥性的菌株之一，其濃度比測(cè)定單個(gè)MIC值時(shí)記錄的濃度低得多，顯示出協(xié)同效應(yīng)。與MK 2.1相反，MK 2.4和MK 3.2（屬于腐生芽孢桿菌物種）抑制類(lèi)棒狀紅球菌MK5.3和辛德勒不動(dòng)桿菌MK 9.1被稱(chēng)為機(jī)會(huì)性人類(lèi)病原體（Dortet al.，2006；Kitamura et al.，2012），這表明了所得結(jié)果的重要性。在大多數(shù)情況下，當(dāng)乳香精油的濃度為0.031 mg/mL時(shí)，會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用；或在沒(méi)藥精油0.031-0.063mg/mL的濃度之間。三個(gè)分離株（MK 1.5、MK 8.1和MK 9.3中檢測(cè)到相加作用，只有兩個(gè)分離株（MK 5.4和MK 7.1）檢測(cè)到拮抗作用，而在分離株MK 2.3、MK 7.2和MK 9.4中，在任何油濃度組合下均未記錄到任何類(lèi)型的相互作用。

本文給出的結(jié)果表明，與單一精油的作用相比，乳香精油和沒(méi)藥精油的組合被證明對(duì)真菌和細(xì)菌都更有效。自公元前1500年起，乳香精油和沒(méi)藥精油就被用于醫(yī)療目的，但在DeRapper等人（2012）的研究之前，沒(méi)有進(jìn)行任何研究來(lái)證實(shí)混合油有更強(qiáng)抗菌作用。盡管在任何組合中均未檢測(cè)到乳香精油，但作者確實(shí)驗(yàn)證了各種乳香和沒(méi)藥物種獲得的混合精油的增強(qiáng)抗菌效果。在所有測(cè)試的精油組合中，構(gòu)樹(shù)乳香和沒(méi)藥對(duì)致病性新型隱球菌和綠膿桿菌的總體相互作用最好。

3.8. 細(xì)菌對(duì)精油揮發(fā)相和熏香煙霧的敏感性

為了測(cè)試乳香精油揮發(fā)相和熏香煙霧的抗菌活性，對(duì)17個(gè)選定菌株進(jìn)行了改良的微大氣生物測(cè)定。與微量稀釋法相反，精油液相的MIC值更高，乳香精油的氣相和熏香的抗菌活性顯著增強(qiáng)（表6）。與相應(yīng)的對(duì)照組相比，精油和熏香煙霧對(duì)七種分離株（MK 1.1、MK 1.5、MK 2.7、MK 5.3、MK 6.1、MK 6.3和MK 9.3）的殺菌效果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性。大多數(shù)分離物屬于芽孢桿菌屬和芽孢八疊球菌。在這種情況下，在所有測(cè)試稀釋液中觀察到完全沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)?？偟膩?lái)說(shuō)，對(duì)所有分離株的最佳處理是在精油蒸汽12mg/cm3時(shí)完成。暴露在煙霧中表明，對(duì)于其余的分離株，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異，但記錄的CFU/ mL與對(duì)照組相比有所減少，在大多數(shù)情況下，指數(shù)符號(hào)較低。菌株MK 9.1（辛德勒曲霉菌）和MK 7.1（馬葡萄球菌）的不敏感性被記錄下來(lái)，這并不意外，因?yàn)樵谥暗脑囼?yàn)中沒(méi)有表現(xiàn)它們的協(xié)同作用。通過(guò)Chrom Biodip生物自動(dòng)圖譜測(cè)試評(píng)估，之前只有Basar（2005）證明了熏香煙霧對(duì)枯草芽孢桿菌具有良好的抗菌作用。除松柏烯衍生物和乙酸因香酯外，輪狀聚傘花-4(20),7,11-三烯也認(rèn)為具有抗菌作用。

3.9. 乳香精油和熏香煙霧的原位抗菌應(yīng)用

進(jìn)行的預(yù)處理空氣微生物調(diào)查顯示，中殿和圣器室都存在相當(dāng)程度的微生物空氣污染（圖3）。由于在夏季的高峰期進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)，因此這些高值（中殿4798.94±512.42–6103.13±914.86 CFU/ m3，圣器室1455.17±37.69–2198.92±67.49CFU/ m3）符合季節(jié)性趨勢(shì)。眾所周知，在氣候溫和的地理區(qū)域，微生物繁殖體的最大濃度通常出現(xiàn)在相對(duì)濕度最高的夏季或秋季（Montacutelli等人，2000年）。目前，對(duì)于文化遺產(chǎn)場(chǎng)所空氣中微生物繁殖體的最大允許濃度，沒(méi)有普遍認(rèn)可和接受的標(biāo)準(zhǔn)；然而，根據(jù)Cappitelli等人（2009）；Nunes等人（2013年）；Micheluz等人（2015年）給出的標(biāo)準(zhǔn)，Holy Ascension老教堂的中殿和圣器室中空氣的微生物污染程度是最大允許濃度的幾倍。

用乳香精油蒸汽處理圣器室中的空氣半小時(shí)后，空氣傳播中的活真菌數(shù)量減少了45.39±2.83%（M40Y）和35.61±2.12%（MEA），而細(xì)菌數(shù)量減少了51.21±3.47%（MHA）和67.56±3.12%（MHA+N）（圖3）。這些結(jié)果與體外記錄的良好抗真菌和抗菌活性一致。在精油處理之前，仔細(xì)注意選擇合適的應(yīng)用方法、處理時(shí)間和精油濃度?？紤]到精油在氣相中的抗菌潛力，其他方法也存在問(wèn)題，因此選擇自然蒸發(fā)作為分散精油的方式。加熱會(huì)增加蒸發(fā)率，精油的抗菌效果會(huì)受到影響，因?yàn)槠淠承┏煞挚赡軙?huì)被改變或破壞（Su等人，2007年）。另一方面，由于酚類(lèi)化合物在水中的溶解度很差，并且羥基化合物的揮發(fā)性降低，因此使用空氣洗滌器不是分散精油蒸汽非常有效的方法，而香薰燈的使用并不方便，因?yàn)閾]發(fā)物可以從高揮發(fā)性單萜烯類(lèi)化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛽]發(fā)性單萜烯醇和倍半萜烯類(lèi)化合物（Oberhofer等人，1999年；Sato等人，2006年）。根據(jù)公布的數(shù)據(jù)，決定讓精油自然蒸發(fā)30分鐘，這些數(shù)據(jù)表明，在蒸發(fā)開(kāi)始后的這段時(shí)間內(nèi)，大多數(shù)揮發(fā)性有機(jī)化合物的最高排放量才被記錄為精油的抗菌活性（Su等人，2007）。最后，對(duì)于液相或氣相的原位抗菌應(yīng)用，需要比在體外獲得MIC、MFC和MBC值時(shí)更高的精油濃度，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基中測(cè)試時(shí)，精油通常是更有效的抗菌劑，并且需要更高的濃度才能在原位產(chǎn)生相同的效果（Laird和Phillips，2011）。

在減少微生物空氣污染方面，香熏處理比精油蒸汽處理更有效，活真菌數(shù)量減少78.95±1.87%（M40Y）和80.43±2.07%（MEA），細(xì)菌數(shù)量減少53.33±1.86%（MHA）和91.43±1.26%（MHA+N）（圖3）。這些結(jié)果為最初的假設(shè)提供了一個(gè)新的實(shí)踐維度，即空氣凈化是通過(guò)重要的傳統(tǒng)燒香儀式實(shí)現(xiàn)的。

圖3. 用a.乳香精油（EO）蒸汽；b.點(diǎn)燃熏香的煙霧處理空氣中的活真菌（F）和活細(xì)菌（B）繁殖體的原位抗菌還原。

4.結(jié)論

從具有眾所周知且有文獻(xiàn)記載的傳統(tǒng)用途的乳香樹(shù)脂和沒(méi)藥樹(shù)脂中得到的精油，其抗菌性能的研究表明，乳香精油和沒(méi)藥精油作為天然抗菌劑具有潛在的能力。盡管具有很高的抗菌潛力，但沒(méi)藥精油的產(chǎn)量太小，無(wú)法證明任何潛在的原位抗菌應(yīng)用。相反，乳香精油的氣相及其熏香在減少空氣中真菌和細(xì)菌繁殖體的數(shù)量方面取得了顯著的效果，從而表明它們可能被用作除日常儀式之外的神圣環(huán)境中偶爾進(jìn)行空氣凈化的一種手段。

“牢記古人的智慧，在本文中，我們通過(guò)提供證據(jù)證明乳香精油和點(diǎn)燃其熏香的煙霧具有強(qiáng)大的抗菌活性，從而證明了熏香在宗教儀式之外的價(jià)值。這一證據(jù)表明，它們可能在神圣的氛圍中用作凈化空氣?！?-作者

翻譯：蔡尉彤

編輯校對(duì)：Tao Feng